Note: Prime Editing: Genome Editing for Rare Genetic Diseases Without Double-Strand Breaks or Donor DNA

Note: Prime Editing: Genome Editing for Rare Genetic Diseases Without Double-Strand Breaks or Donor DNA

doi: 10.3389/fgene.2020.00528

เพราะเห็นชื่อบริษัท Beam therapeutic ผ่านทาง ARK investment เลยคลิ๊กเข้าไปดูรายละเอียดปรากฎว่าเป็นบริษัทที่ใช้เทคโนโลยีใหม่ในการตัดแต่งจีโนม หลัก ๆ ก็ยังใช้ Cas9  (ซึ่งเทคโนโลยี Cas9 ก็มีบริษัท CRISPR therapeutics เป็นของตัวเองเหมือนกัน แต่ยังคงใช้ template DNA ในการกระบวนการตัดแต่งจีโนมอยู่) แต่ว่าไปทำการเปลี่ยนแปลงหน้าที่ของ Cas9 เช่น ทำให้มีความสามารถตัดแบบสายเดียว หรือ ทำให้ส่วนที่เป็น endonuclease สูญเสียฟังก์ชันไปเลย และเอาตัว Cas9 ไปเชื่อมกับ เอนไซม์ตัวอื่น ๆ ที่สามารถตัดแต่งลำดับเบสใน DNA/RNA ได้ ซึ่งมีตั้งแต่ deaminase enzyme และ reverse-transcriptase ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ในการตัดต่อ genome ว่าจะเป็นไหน

Link สำหรับโพสต์เก่าสำหรับการอธิบายอย่างง่าย ๆ ในเรื่องการตัดแต่งพันธุกรรม

Prime editing -- 

• Using longer than usual guide RNA -- known as prime editing gRNA (pegRNA)

• Fusion protein Cas9-H840A nickase fused to an engineered reverse transcriptase (RT)

• Technology called -- “search-and-replace” base-editing

• Because this technology uses the pegRNA as a primer to initiate polymerase reaction, thus no donor template (correct template) is required.

The conventional technology of CRISPR-Cas9

• Generate DSB by Cas9

• Repair through NHEJ/HR depending on

• Genome (location)

• Cellular heterogeneity (each single cell is different)

• Cell cycle 

• This technology is relied heavily on HDR

- Limitation;

- Mammalian cells are hard to do due to low HR rate,  correction rate ~ 0.1-5%

- Hard to deliver donor DNA

- Introduce plenty of random indel

Prime editing technology

• Using base editors

• Generate mutations at single-base resolution

• Not all transition mutations could be done, only four, thus some diseases might need the conventional Cas9 technology to correct the gene

• C->T

• G->A 

• A->G

• T->C

Prime editors (PE)

• PE-1

• Fusion of Cas9 H840A nickase+WT of Maloney murine leukemia virus RT enzyme

• Cas9 H840A nickase -- digest only one strand of DNA

• Maloney murine leukemia virus RT -- synthesis cDNA  by using pegRNA as primer

• PE-2

• Improved version of PE-1

• Introduce 5 specific mutations which result in

• Better thermostability

• Better Processivity

• Better DNA-RNA substrate affinity

• PE-3

• Introduce a second gRNA in addition to pegRNA

• To guide Cas9 H840A and nick the genomic DNA at the nearby site but opposite to the original site -- to enhance the base editing efficiency (by avoiding mismatched repair)

Challenges for PE;

• Not be able to confer large DNA insertions or deletions (but conventional Cas9 can)

• Desired sequence must be encoded into extensive RNA molecule -- making it long, thus, stability is the concern, for example, being digested by intracellular RNA-degrading enzyme

• RT might create random cDNA, thus, incorporate in the genome

• Protein constructs (two proteins are fused)-- too large -- delivery system required optimization

Pre-clinical step challenges to treat rare genetic disorders

• Optimizing prime editors -- maximizing efficacy but less side effect

• Maintain good efficacy in different cell types

• Rare disease model to be tested + molecular mechanism which will enable these system work effectively